ResearchPad - 基础研究 https://www.researchpad.co Default RSS Feed en-us © 2020 Newgen KnowledgeWorks <![CDATA[Toppgene筛选肺腺癌候选疾病基因]]> https://www.researchpad.co/article/5b5b887c463d7e1effa460f0 肺腺癌是危害人类健康最主要的肺癌类型之一,其发生机制仍不清楚。本研究利用生物信息学方法,筛选新的肺腺癌候选基因,为揭示肺腺癌发病机制提供依据。方法从GEO数据库中获得GSE10072和GSE7670两个数据集,然后利用dchip软件进行差异表达基因分析,将其获得的差异基因定义为“检测基因集”(test gene set);采用genecard和Fable文献挖掘已知肺腺癌疾病基因,并将其定义为“训练基因集”(train gene set);最后,利用Toppgene筛选肺腺癌候选基因,并通过荧光定量PCR对其获得的部分基因进行验证。结果获得一个含344个基因的“检测基因集”和含277个基因的“训练基因集”。采用Toppgene共获得36个候选疾病基因,其中21个基因则在肿瘤方面的研究几无报道。荧光定量PCR实验研究发现,CD36PMAIP1FABP4三个基因在A549细胞中均为下调表达,与芯片数据一致。结论Toppgene可发现新的肺腺癌候选疾病基因,为下一步发现特异性肺腺癌致病基因提供理论依据。 ]]> <![CDATA[体外诱导建立NCI-H2228/Crizotinib耐药细胞株的方法学探讨及鉴定分析]]> https://www.researchpad.co/article/5b5b86bf463d7e1effa460e8 小分子靶向药物发生耐药的机制及寻找克服耐药的手段是目前提高临床疗效需要迫切解决的问题。本研究探讨采用不同方法建立对Crizotinib耐药的非小细胞肺癌NCI-H2228/Crizotinib细胞株的可行性及鉴定分析,为深入研究Crizotinib耐药发生的机制并寻找克服耐药的手段提供实验基础和理论依据。方法采用逐步增加药物浓度和化学诱变剂处理NCI-H2228细胞,诱导细胞对Crizotinib耐药。MTT法检测亲本细胞和耐药细胞的50%抑制浓度(50% inhibitory concentration, IC50)和群体倍增时间。RT-PCR和Western blot实验检测棘皮动物微管相关蛋白样4-间变性淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule-associated protein like 4-anaplastic lymph kinase, EML4-ALK)基因表达。对耐药细胞和亲本细胞的EML4-ALK基因全长测序并对比分析发生耐药的机制。结果逐步增加药物浓度的方法耗时过长,细胞恢复生长缓慢,不能有效诱导NCI-H2228细胞对Crizotinib耐药;化学诱变剂ENU可以在短时间内诱导NCI-H2228细胞对Crizotinib耐药[IC50=(3.810±1.100)μmol/L,P=0.002, 9,vs亲本细胞]。耐药细胞EML4-ALK基因发生点突变的频率高于亲本细胞。结论化学诱变剂诱导细胞耐药操作简便,可有效缩短实验流程,为深入研究耐药发生机制,寻找克服靶向药物耐药的手段提供了前期技术方法和实验依据。 ]]> <![CDATA[CK2α通过PI3K/Akt/GSK-3β信号通路调控肺腺癌A549细胞的侵袭及迁移]]> https://www.researchpad.co/article/5b5b8619463d7e1effa460e5 肺癌已成为全球癌症死亡的首要原因,而侵袭和转移是导致肿瘤死亡的主要原因之一,蛋白激酶CK2是一种高度保守信使非依赖性丝氨酸苏氨酸蛋白激酶,其在各种肿瘤中高表达。本研究旨在探讨下调CK2α基因表达对肺腺癌A549细胞侵袭迁移的影响以及可能的机制。方法构建pSilencerTM 4.1-shCK2α-eGFP慢病毒表达载体,建立稳定干扰CK2α表达的A549细胞株。利用Transwell和Boyden小室实验检测干扰CK2α表达前后A549细胞的侵袭及迁移的能力。Western blot检测PI3K/Akt信号通路和上皮-间充质转化(mesenchymal-to-epithelial transition, EMT)相关蛋白的表达。结果与对照组相比,干扰CK2α表达后肺腺癌A549细胞的侵袭及迁移能力明显下降,p-PTEN、Akt、p-Akt473、p-Akt308、p-PDK1、p-c-Raf、p-GSK-3β蛋白明显下调,PTEN蛋白表达水平显著上调。上皮-间充质转化的相关蛋白E-cadherin蛋白表达水平显著上调,而Vimentin、β-catenin、Snail蛋白表达水平显著下调,与侵袭转移相关蛋白的MMP2、MMP9表达水平显著下调。结论CK2α可能通过PI3K/Akt/GSK-3β/Snail信号通路来调控上皮-间充质转化参与肺腺癌A549细胞的侵袭及迁移。 ]]> <![CDATA[吉非替尼耐药的人肺腺癌HCC-827/GR细胞乙醛脱氢酶亚型表达分析]]> https://www.researchpad.co/article/5c053697d5eed0c4848be2fd 肿瘤的复发和耐药是肿瘤患者死亡的主要原因。乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase, ALDH)家族与肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和耐药密切相关,且ALDH不同亚型基因在不同肿瘤细胞中有差异性表达。本实验旨在分析对吉非替尼耐药的人肺腺癌细胞HCC-827/GR ALDH亚型的表达。方法利用人肺腺癌细胞系HCC-827制备吉非替尼耐药细胞株HCC-827/GR;利用流式检测HCC-827及HCC-827/GR中ALDH的表达;采用MTT法检测ALDH抑制剂二乙氨基苯甲醛(diethyllaminaldehyde, DEAB)处理前后HCC-827/GR细胞的增殖能力和对吉非替尼的敏感性;利用qRT-PCR检测HCC-827与HCC-827/GR细胞中ALDH各亚型在mRNA水平的表达。结果与HCC-827细胞相比,ALDH在吉非替尼耐药的细胞株HCC-827/GR的阳性率增加;经100 μmol/L DEAB处理后,HCC-827/GR细胞增殖能力下降;与HCC-827细胞相比,ALDH1A1和ALDH1L1在HCC-827/GR细胞中mRNA表达水平增高;ALDH3B2表达降低。结论ALDH具有检测吉非替尼耐药的人肺腺癌细胞的标志分子的潜力,其中ALDH1A1可能参与人肺腺癌细胞对吉非替尼耐药性的形成过程。 ]]> <![CDATA[器官特异性转移肺癌细胞株的筛选及建立]]> https://www.researchpad.co/article/5c0532c9d5eed0c4848b5d5b 肺癌转移是肺癌的恶性标志和特征,也是肺癌病人治疗失败和死亡的主要原因。肺癌转移具有器官特异性,最常转移的部位是淋巴结、大脑、骨、肝脏和肾上腺。本研究的目的是应用我们实验室的人高转移大细胞肺癌细胞株L9981,筛选鉴定出具有器官特异性转移的肺癌亚代细胞株,为进一步研究肺癌细胞器官特异转移提供科学可靠的细胞模型。方法通过裸鼠实验,将母系细胞株L9981-Luc皮下接种,每周一次动物活体成像观察肺癌器官转移情况,数周后构建出具有肺、脊柱、纵隔淋巴结和大脑等器官特异性转移的小鼠模型;处死裸鼠,切取肺、脊柱、纵隔淋巴结和大脑器官肺癌转移瘤进行原代培养,构建具有器官靶向特异性转移潜能的肺癌亚代细胞株;将第一代器官特异性转移肺癌细胞株接种裸鼠皮下,再次构建肺癌器官特异性转移小鼠模型;通过反复多次将肺癌器官特异性转移瘤构建肺癌细胞株,再裸鼠接种,最终获得具有肺、脊柱、纵隔淋巴结和大脑器官特异性转移的肺癌细胞株。结果经过裸鼠反复接种,动物活体成像、动物体内反复筛选鉴定,成功构建了4株分别特异性转移到肺、脊柱、纵隔淋巴结和大脑的器官特异性转移肺癌细胞株,分别命名为L9981-LuM、L9981- BoM、L9981-LnM和L9981-BrM。结论成功构建出具有肺、纵隔淋巴结、脊柱和大脑特异性转移的人大细胞肺癌细 胞模型,为进一步研究肺癌器官特异转移的分子机制、信号调控途径,以及未来研究和开发抑制或/和阻断肺癌转移的分子靶向药物提供了可靠的细胞模型。 ]]> <![CDATA[具有不同酶活性并可抵抗特异shRNA降解的nm23-H1真核表达载体的构建和表达]]> https://www.researchpad.co/article/5c0532bfd5eed0c4848b5c4f 已有的研究证明nm23-H1基因是一个重要的肿瘤转移抑制基因,但其抑制肿瘤转移的生化机理尚不完全清楚。Nm23-H1基因结构和功能异常与肿瘤的侵袭转移有密切关系。我们前期已构建了nm23-H1的短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)载体以及可抵抗此shRNA降解的nm23-H1的cDNA的表达载体,在此基础上我们欲应用基因定点突变技术构建具有不同酶活性并能抵抗此shRNA降解的nm23-H1cDNA真核表达载体,并通过恢复实验验证其表达,为进一步研究肿瘤抑制基因nm23-H1的分子机制提供理论基础和实验依据。方法以pcDNA3.1(+)-shRNA-resistant-nm23-H1质粒为突变模板,应用重叠延伸PCR方法引入nm23-H1基因四个单点突变和一个联合位点突变,并将突变基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1Hygro(+)。将突变质粒转染人肺腺癌细胞株A549/nm23-H1-shRNA(稳定沉默nm23-H1基因),利用Western blot技术验证不同突变体nm23-H1蛋白的表达。结果成功构建了shRNA抵抗的nm23-H1S44A、nm23-H1P96S、nm23-H1H118F、nm23-H1S120G、nm23-H1P96S-S120G五个突变型真核表达载体,经DNA序列分析突变的碱基序列与实验设计完全一致,经Western blot验证nm23-H1蛋白表达正常。结论成功构建了五个具有不同突变位点的shRNA抵抗的nm23-H1基因真核表达载体,并且突变蛋白质nm23-H1表达正常,同时也表明重叠延伸PCR技术是一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。 ]]> <![CDATA[<sup>99m</sup>Tc标记T7肽及其在裸鼠非小细胞肺癌模型体内的生物分布研究]]> https://www.researchpad.co/article/5c0532bbd5eed0c4848b5be5 肺癌是一种死亡率极高的恶性肿瘤,针对肺癌的早期诊断和治疗有着重要的意义和价值,本研究旨在探讨羰基锝法标记的肿瘤抑素T7肽用作裸鼠肺癌早期显像剂的初步研究。方法采用羰基锝法标记T7肽,薄层色谱法检测99mTc-T7的放化纯度与稳定性,丙酮作展开系统。测定99mTc-T7与NCI-H157细胞的亲和力。研究99mTc-T7于0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h在荷人非小细胞肺腺癌裸鼠体内的生物分布特性,并计算肿瘤(T)与非肿瘤组织(NT)放射性比值。结果99mTc对T7肽标记率高,放化纯度达90%以上,不需进一步纯化,体外稳定性好。99mTc-T7与NCI-H157细胞的平衡解离常数为196.1 nM。99mTc-T7在裸鼠体内主要通过内脏器官代谢,血液清除较快,在肿瘤部位有一定程度聚集,肿瘤/肌肉比值随时间延长而增加,可达到5以上,在4 h-8 h之间取值较为理想。99mTc-T7在肺内存在一过性聚集。结论99mTc-T7制备方法简便,标记率高,稳定性好,并能在肺癌肿瘤部位聚集,有望用作肺癌SPECT/CT显像剂。 ]]> <![CDATA[肺癌细胞中miR-182启动子甲基化状态研究]]> https://www.researchpad.co/article/5c053091d5eed0c4848b0f5a 已有的研究证明MiR-182的异常调控与恶性肿瘤的发生发展密切相关,本研究旨在探讨肺癌细胞中miR-182启动子的甲基化状态对miR-182表达的影响。方法荧光定量PCR检测肺癌细胞中miR-182表达水平,甲基化特异性PCR检测各细胞株中miR-182启动子区的甲基化状态,并通过测序进行验证。DNA甲基转移酶抑制剂5’-Aza-dC处理后检测各肺癌细胞株中miR-182表达变化。结果MiR-182在不同肺癌细胞株的表达水平不同,其中,在高转移性肺癌细胞株如A549和L9981中相对呈低表达;而在低转移性细胞株95C则相对呈高表达。MSP及测序分析显示多株肺癌细胞株中miR-182启动子区域存在DNA甲基化,其中A549细胞甲基化程度最高。在5'-氮杂-脱氧胞苷酸(5’-Aza-dC)作用下,A549细胞及其他肺癌细胞中miR-182表达水平均明显升高。结论在肺癌细胞中miR-182启动子区域存在异常甲基化,miR-182的表达受DNA甲基化的调控。MiR-182的甲基化在肺癌中的作用尚需进一步研究。 ]]> <![CDATA[胸腔内注射重组人血管内皮抑素对裸鼠恶性胸腔积液的治疗作用]]> https://www.researchpad.co/article/5c05308fd5eed0c4848b0f0d 恶性胸腔积液(malignant pleural effusion, MPE)临床预后不佳,胸腔内抗血管治疗可能对恶性胸腔积液具有治疗作用,本研究旨在探讨胸腔内注射重组人血管内皮抑素、顺铂、重组人血管内皮抑素联合顺铂对裸鼠恶性胸腔积液的治疗作用。方法BALB/c裸鼠胸膜腔内注射Lewis肺癌细胞(Lewis lung cancer cell, LCC)构建恶性胸腔积液模型,造模后分别胸腔内注射重组人血管内皮抑素(E)、顺铂(P)以及重组人血管内皮抑素联合顺铂(EP)并分析各组裸鼠胸腔积液量、胸膜肿瘤微血管密度(micro vessel density, MVD)以及血管生成、凋亡相关基因的表达变化。结果重组人血管内皮抑素及重组人血管内皮抑素联合顺铂胸腔内注射可以使裸鼠MPE量减少,且与裸鼠胸腔肿瘤组织MVD下降呈正相关;且重组人血管内皮抑素及重组人血管内皮抑素联合顺铂胸腔内注射后,MPE裸鼠胸腔肿瘤组织血管内皮生长因子(Vescular epidermal growth factor-α, VEGF-α)表达下降、低氧诱导因子-α(hypoxia induced factor-1, HIF1-α)表达升高。结论胸腔内注射LLC细胞可成功制作裸鼠MPE模型。重组人血管内皮抑素裸鼠胸膜腔内注射对MPE裸鼠具有治疗作用,其治疗作用可能是通过下调VEGF-α,抑制肿瘤新生血管生成,下调微血管密度而达成的。 ]]> <![CDATA[硫利达嗪对肺癌PC9细胞的杀伤效应及其机制]]> https://www.researchpad.co/article/5c05307ad5eed0c4848b0cce 硫利达嗪作为一种吩噻嗪类抗精神疾病药物,近期研究显示其在体外可抑制多种肿瘤细胞的增殖,但对肺癌的作用尚未见报道。本实验以PC9细胞株为研究对象,旨在观察硫利达嗪对其杀伤效应以及探讨其可能的作用机制。方法不同浓度的硫利达嗪作用PC9细胞后,四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyltetrazolium, MTT)法检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡率,Western blot检测周期相关蛋白CyclinD1及凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、Bax、Bcl-xl表达水平。结果硫利达嗪可显著抑制PC9细胞的增殖,其抑制作用呈时间和浓度依赖性。流式结果显示:随着硫利达嗪药物浓度的增高,细胞发生不同程度的G0/G1期阻滞,细胞凋亡率明显增高。各实验组与对照组比较,差异有统计学意义(P < 0.05)。Western blot结果显示:与对照组比较,实验组CyclinD1、Bcl-2、Bcl-xl表达水平明显下调(P < 0.01),Bax表达水平明显上调(P < 0.01),Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性显著增加(P < 0.01)。结论硫利达嗪可显著抑制PC9细胞的增殖,其机制可能与其激活Caspase内外源性凋亡途径,下调CyclinD1、Bcl-2、Bcl-xl,上调Bax有关。 ]]> <![CDATA[PEPT2 mRNA在肺纤维化大鼠肺组织中的表达]]> https://www.researchpad.co/article/5c05306bd5eed0c4848b0b46 肺纤维化是肺癌放化疗后的常见病理改变,是阻碍药物转运到肺部的关键因素之一,肽转运载体已经成为合理设计肽和肽类药物的靶标,本研究旨在探讨肽转运载体2(peptide transporter 2, PEPT2)mRNA在肺纤维化大鼠肺组织中的表达。方法健康SD大鼠50只,随机分为5组。博莱霉素(bleomycin, BLM)7 d、14 d、28 d组:气管内一次性滴入博莱霉素溶液复制肺纤维化大鼠模型,分别于给药后7 d、14 d和28 d放血处死;生理盐水组滴入等量生理盐水,于14 d放血处死;正常组不做任何处理。各组取肺组织,光镜观察组织病理变化;检测样本羟脯氨酸含量;半定量RT-PCR检测肺组织PEPT2 mRNA表达。结果BLM 7 d组大鼠肺组织呈急性炎症性改变,无纤维增生;BLM 14 d组和28 d组大鼠肺组织均有纤维化改变,以28 d组最为明显。BLM 7 d组肺组织羟脯氨酸含量与正常对照组和生理盐水组相比无统计学差异(P > 0.05);14 d组和28 d组大鼠肺组织羟脯氨酸含量均高于正常对照组和生理盐水组(P < 0.05)。各组肺组织PEPT2 mRNA的相对表达量无统计学差异(P > 0.05)。结论PEPT2 mRNA在博莱霉素致肺纤维化大鼠肺组织表达水平无明显变化,PEPT2可能是设计肺纤维化的新型肽类药物靶标之一。 ]]> <![CDATA[重组人血管内皮抑素与多西紫杉醇不同顺序用药调控移植瘤组织MMP及抗瘤效应观察]]> https://www.researchpad.co/article/5c05305ad5eed0c4848b08f2 通过药物干预性动物实验,观察重组人血管内皮抑素(rh-endostatin)与多西紫杉醇不同顺序联合用药后MMP-2及相关因子的变化及其对移植瘤生长与血管生成的影响,探索两药联合的作用机制和最佳抗肿瘤方案。方法建立肺腺癌A549荷瘤裸鼠模型,分两个阶段进行实验。第一阶段:将荷瘤小鼠随机分为重组人血管内皮抑素组(重组人血管内皮抑素400 μg·d-1,d1-d14)和多西紫杉醇组(多西紫杉醇10 mg·kg-1·3d-1,d1-d14);第二阶段:将荷瘤小鼠随机分为同时用药组(重组人血管内皮抑素400 μg·d-1、d1-d35,多西紫杉醇10 mg·kg-1·3d-1、d1-d19)、先重组人血管内皮抑素组(重组人血管内皮抑素400 μg·d-1、d1-d35,多西紫杉醇10 mg·kg-1·3d-1、d16-d34)和模型组。实验中动态测量移植瘤体积,结束后以免疫组化方法检测MMP-2、TIMP-2、EMMPRIN表达并计数微血管密度(MVD)。结果两单药组比较,重组人血管内皮抑素组MMP-2和EMMPRIN表达下调较多西紫杉醇组(P=0.024, P=0.081)明显,两组间TIMP-2表达无明显差异(P > 0.05)。联合组用药结束时,同时用药组与先重组人血管内皮抑素组的移植瘤体积小于模型组(P < 0.001, P=0.003),且MMP-2表达均明显下调、微血管数减少(P < 0.05),但同时用药组对肿瘤生长的抑制较先重组人血管内皮抑素组明显;与模型组相比,同时用药组TIMP-2上调(P=0.001)、EMMPRIN下调(P=0.018),先重组人血管内皮抑素组未见相似结果。结论同时用药方案可以从TIMP-2、EMMPRIN两个环节下调MMP-2的表达,从而更好地抑制肿瘤生长。 ]]> <![CDATA[荷人肺癌小鼠皮下移植瘤模型的建立及其生物学特性初探]]> https://www.researchpad.co/article/5c053057d5eed0c4848b0822 为了更好地研究肺癌的治疗方法,建立起可靠的动物评价模型迫在眉睫。本研究的目的是研究建立肺癌原代组织块小鼠移植瘤模型的成熟方法,观察移植瘤的肿瘤生物学特性,在建模方法及基本特征等方面来证明该肿瘤模型的合理性和科学性,以期为肿瘤研究提供更有效的实验动物模型。方法取人新鲜完整肺癌组织块移植于NOD/SCID小鼠右侧前肢肩背部皮下,或经皮肺穿刺取得肿瘤小块移植于BALB/c裸小鼠肾包膜下。待皮下肿瘤增大,将其切下传代于裸小鼠右侧前肢肩背部皮下。观察移植瘤生物学特性,并取肿瘤行常规病理切片及CEA、细胞角蛋白、Ki67免疫组化检测,将原代肿瘤和移植瘤进行EGFR 18-21外显子和K-Ras 12,59外显子基因检测,采用流式细胞仪检测移植瘤细胞的细胞周期。结果本研究进行了11例肺癌组织的NOD/SCID小鼠和裸鼠建模,建成3例可多次成功传代的腺癌、小细胞肺癌和鳞癌模型。传代移植成功率高。荷瘤小鼠生长情况良好,生存期长。各代移植瘤模型的组织病理学及免疫组化表型、EGFRK-Ras基因检测均与来源肺癌组织相一致。移植瘤细胞周期中S期延长,提示瘤细胞有增殖活性。结论本研究在国内首次利用新鲜的完整肺癌组织建成了荷肺癌NOD/SCID小鼠及裸鼠模型,并传代移植于裸鼠,建模成功率为27%。移植瘤较好地保留了人原发肺癌的恶性特征及组织病理学、生物学特性,是一种接近人体的肺癌模型,可为肺癌研究提供良好的实验平台。 ]]> <![CDATA[SIRT1通过调节Noxa表达影响非小细胞肺癌细胞株A549对顺铂的敏感性]]> https://www.researchpad.co/article/5c053051d5eed0c4848b07a7 非小细胞肺癌的顺铂耐药是常见的临床现象,严重制约了患者的化疗效果,是亟待解决的问题。SIRT1和Noxa的表达变化影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。本研究旨在研究SIRT1表达对非小细胞肺癌对顺铂的敏感性的影响,并探讨其涉及Noxa表达的机制,以求为提高非小细胞肺癌细胞对顺铂敏感性提供希望。方法利用实时荧光定量PCR和Western blot分析A549细胞及顺铂耐药的A549/DDP细胞SIRT1及Noxa mRNA和蛋白水平的表达差异。利用siRNA干扰技术抑制A549/DDP细胞的SIRT1表达,进而使用Cell Titer Blue试验、流式细胞术从细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡方面分析SIRT1沉默对A549/DPP细胞顺铂敏感性的影响。同时利用实时荧光定量PCR和Western blot分析SIRT1抑制对A549/DPP细胞Noxa表达的影响。结果A549细胞和A549/DDP细胞对顺铂的敏感性有显著差异,与A549细胞相比,A549/DDP细胞的SIRT1表达较高,但Noxa表达较低。使用siRNA抑制A549/DPP细胞的SIRT1表达后,与未抑制SIRT1细胞相比,4 μg/mL顺铂处理后的细胞存活率降低,G2期/M期阻滞比例增加,凋亡率提高。同时,SIRT1沉默导致A549/DPP细胞的Noxa表达增加。结论较高的SIRT1可能引起A549细胞对顺铂的耐药性,抑制SIRT1可以提高A549/DDP细胞对顺铂的敏感性,其机制可能涉及SIRT1对Noxa的调节。 ]]> <![CDATA[纳米二氧化硅在人支气管上皮细胞内的亚细胞分布和遗传毒性]]> https://www.researchpad.co/article/5c053044d5eed0c4848b0653 纳米二氧化硅广泛应用于社会生产生活中,肺部是吸入暴露纳米二氧化硅的主要靶器官,因此,二氧化硅对肺部的生物毒性作用引起人们的广泛关注。本研究旨在探讨纳米二氧化硅在人支气管上皮细胞内的亚细胞分布和遗传毒性。方法应用透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)观察不同粒径二氧化硅在人支气管上皮细胞(immortalized human bronchial epithelium cells, BEAS-2B)内的亚细胞分布;应用单细胞凝胶电泳检测不同粒径二氧化硅处理BEAS-2B细胞24 h后的DNA损伤,了解不同粒径二氧化硅的遗传毒性作用。结果透射电镜观察到微米二氧化硅不能进入细胞,纳米二氧化硅赋存在细胞质,纳米二氧化硅导致线粒体、内质网等细胞器损伤。纳米二氧化硅导致比微米二氧化硅更严重的DNA损伤(P < 0.05)。结论二氧化硅的粒径决定二氧化硅颗粒物是否能进入细胞及在细胞内的分布,纳米二氧化硅对细胞遗传毒性比微米二氧化硅严重。 ]]> <![CDATA[树突状细胞的体外培养及其抗癌作用]]> https://www.researchpad.co/article/5c052cd3d5eed0c4848a8d75 恶性肿瘤患者免疫力低下,缺乏强有力的抗肿瘤免疫应答,其原因是肿瘤细胞的抗原性较弱,而且抗原提呈细胞的功能低下,使肿瘤抗原不能有效地提呈给淋巴细胞。因此如何能有效地诱导出抗肿瘤免疫效应是一个非常关键的问题。本研究通过建立体外培养树突状细胞(dendritic cells, DC)的方法并观察其诱导的抗肺癌作用的研究,为以DC为基础的肺癌免疫瘤苗的临床应用提供实验依据。方法3 mol/L氯化钾法提取人肺腺癌细胞GLC-82的可溶性抗原多肽;从人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中用GMCSF、IL-4和TNF-α体外诱导扩增DC,用流式细胞仪FCM及免疫染色法分析鉴定DC;肺癌肿瘤可溶性抗原(tumor soluble antigen, TSA)和超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A, SEA)联合修饰致敏DC;以联合抗原修饰后的DC、单纯肺癌抗原TSA致敏的DC、单纯超抗原SEA修饰的DC和未经抗原修饰的DC分别与外周血T淋巴细胞共同孵育,刺激T淋巴细胞活化增殖,诱导产生具有识别肺癌抗原的特异性CTL(作为效应细胞分别称为TSA-SEA-DCL、TSA-DCL、SEA-DCL、DCL);采用MT法检测各效应细胞对靶细胞GLC-82、肺癌CALU-6和人红白血病K562细胞的抗癌活性;镜下观察DC、效应细胞形态及对靶细胞的杀伤过程。结果诱导出高表达CD1a、HLADR、CD80具有典型树突状细胞特性的DC;TSA-SEA-DCL对靶细胞GLC-82的杀伤率明显高于TSA-DCL、SEA-DCL及DCL,亦明显高于对K562细胞的杀伤率;与靶细胞共育时镜下发现效应细胞CTL靠近并聚集在肿瘤细胞周围,致使肿瘤细胞发生变性坏死及凋亡。结论本实验方法能成功诱导出具有典型特征的成熟DC,肺癌TSA联合超抗原SEA诱导的DC疫苗对肺癌细胞有高效特异杀伤作用。 ]]> <![CDATA[中国肺癌发病死亡的估计和流行趋势研究]]> https://www.researchpad.co/article/5c052cc0d5eed0c4848a8ba4 本研究旨在探讨我国肺癌的流行特征,对发病和死亡进行估计。方法对全国肿瘤登记中心收集的全国各肿瘤登记处1988年-2005年18年间上报的肺癌发病和死亡登记的数据资料进行整理。利用2004年和2005年全国第三次死因回顾抽样调查数据中肺癌的死亡率,结合同时期肿瘤登记数据的死亡发病比,估计目前我国肺癌的发病率。选取数据较为齐全的北京、上海、湖北武汉、黑龙江哈尔滨、河北磁县、江苏启东、浙江嘉善、广西扶绥、福建长乐、河南林州10个登记处的资料,通过肺癌发病率的年变化率计算,分析18年间肺癌流行趋势。结果2005年我国肺癌新发病例数为536 407人,死亡病例数475 768人,通过对10个登记处18年发病死亡数据分析,登记点肺癌发病率呈现逐年上升趋势,年平均增长1.63%,但年龄调整后每年降低0.55%。结论肺癌是影响我国居民健康的主要恶性肿瘤,发病和死亡呈现逐年上升趋势,主要的原因是人口老龄化导致的,必须采用积极有效的防治措施。 ]]> <![CDATA[制备两种p53重组腺病毒和流式细胞仪定量外源绿荧光蛋白表达]]> https://www.researchpad.co/article/5c052cbed5eed0c4848a8b73 p53作为转录因子,在细胞应激时呈活化型,可调控细胞周期和程序性死亡抑制肿瘤生长,通常通过各种机制可使p53呈现非活化状态,其中包括p53 C-末端负调控序列的作用。本研究旨在制备携带全长和缺失这些负调控序列p53的两种重组腺病毒,并采用流式细胞仪散点图(flow cytometry scater plot, FCM)检测人肺癌细胞外源绿荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)表达。方法利用pAdEasy-Track载体系统,构建两种p53重组质粒并在细菌中产生重组体,转染L293细胞产生三种重组腺病毒,测序证明。三种不同浓度病毒分别感染人肺癌801D细胞,FCM scater plot检测其GFP表达。结果测序证明重组腺病毒:Ad-p53(del)缺失p53 C-末端终止密码子前111个碱基和非编码区,Ad-p53(wtp)无p53碱基缺失。Ad-(empty carrier)无p53。FCM scater plot显示三种病毒感染801D细胞表达GFP百分率接近并随病毒浓度递增。801D包含了不同荧光强度比率的细胞。结论构建和制备了去C-末端p53和全长p53的两种重组腺病毒:Ad-p53(del)、Ad-p53(wtp)及空载体Ad-(empty carrier)。流式细胞仪散点图证明该病毒试验系统可靠,可定量外源GFP表达为病毒感染细胞选择浓度提供准确方法。 ]]> <![CDATA[地塞米松对顺铂诱导中国人肺腺癌原代细胞凋亡的影响]]> https://www.researchpad.co/article/5c052cb9d5eed0c4848a8ac3 糖皮质激素如地塞米松能诱导淋巴细胞的凋亡并能防治因化疗引发的恶心及呕吐。然而,最近的研究资料显示糖皮质激素能引发欧洲人肺癌治疗耐药。中国人肺腺癌化疗时地塞米松对顺铂抑制肺腺癌原代细胞增殖效应的影响,目前尚不清楚。方法分离10例经病理学确诊为中国人源肺腺癌的原代细胞,经不同浓度的顺铂+/-地塞米松处理,采用四氮唑蓝比色法(MTT)检测肺腺癌原代细胞的增殖状况,并应用流式细胞仪检测顺铂联合地塞米松处理后的人肺腺癌细胞株A549的细胞凋亡率。结果在10例肺腺癌原代细胞中,地塞米松均可降低顺铂抑制肺腺癌原代细胞增殖的效应。同样,人肺腺癌细胞株A549,经顺铂联合地塞米松培养2周和3周后,地塞米松能降低癌细胞因顺铂诱导的细胞死亡率和凋亡率,提示地塞米松对顺铂诱导的细胞凋亡有抑制效应。结论地塞米松可以降低顺铂诱导肺腺癌细胞凋亡的作用,建议在肺腺癌化疗时谨慎使用地塞米松。 ]]> <![CDATA[小鼠Lewis肺癌原位模型的构建]]> https://www.researchpad.co/article/5c052cb3d5eed0c4848a89b4 肺癌原位模型包括小鼠自发性肺肿瘤模型和气道内接种模型等,但自发性肺肿瘤模型耗时较长且成瘤率不能保证,而气道内接种模型成瘤部位及大小不稳定。本研究以3LL细胞系细胞接种于C57BL/6小鼠肺原位,与皮下接种模型比较,探讨其稳定性、转移特性,并建立小鼠肺原位癌模型的优化方法。方法将不同数量级的3LL细胞分别直接接种于C57BL/6小鼠左侧腋下制备皮下接种模型和以Matrigel悬浮后接种于其左肺制备原位接种模型,观察两种模型的生存期,并对小鼠进行解剖后行病理切片检查、免疫组化染色检测微血管密度、流式细胞仪检测CD44v。结果皮下组成瘤率分别为100%、66.7%、16.7%,未见明显转移。原位组成瘤率分别为100%、100%、83.3%,并可转移至对侧胸廓及肺脏。原位组中位生存期(38 d、35 d、23 d)明显少于皮下接种组(82 d、72 d、50 d)。原位接种组微血管密度(120.2±9.73)高于皮下组(92.6±7.12)。原位接种组肿瘤细胞悬液CD44v表达(26.46±1.56)%高于皮下接种组(23.13±1.02)%。结论以3LL细胞接种于小鼠肺部所建立的肺癌原位模型简单可靠,重复性高,具有较皮下接种模型更强的转移特性。 ]]>